Método

Formación del precursor [^99mTc(H₂O)₃(CO)₃]⁺

Se incorporan 4 mg de carbonato de sodio (Na₂CO₃), 7 mg de borohidruro de sodio (NaBH₄) y 20 mg de tartrato de sodio y potasio (C₄H₄O₆NaK) en un vial sellado y se purga con CO (g) durante 15 min a presión constante. A esa mezcla se agrega entre 740 a 1110 MBq (20-30 mCi) de pertecneciato (99mTcO₄^-) en aproximadamente 1 mL de solución salina. Se incuba la preparación en un baño de agua a 70ºC durante 20 min. Una vez finalizado el calentamiento, se neutraliza con buffer fosfato (NaH₂PO4) 390 mg/mL en una relación volumen/volumen de (4:1) carbonilo: fosfato. El pH debe ser de 7 al final de la neutralización. La pureza radioquímica del precursor tricarbonílico es controlada por HPLC (fig. 2).

Sistema de HPLC

Columna: Macherey-Nagel C18 5μ 25cm.
Flujo: 1,0 mL/min.
Fase móvil: A- Buffer fosfato trietilamina (2.86mL de H₃PO₄ por litro) pH: 2,5.
B-Metanol.
Gradiente: 0 a 3 min 100% A.
3 a 6 min de 100% a 75% de A.
6 a 9 min de 75% a 66% de A.
9 a 20 min de 66% a 0% de A.
20 a 27 min 0% de A.
27 a 30 min de 0% a 100% de A.

Sustitución del acuo complejo

La sustitución de las moléculas de agua del precursor por el ligando de interés, en este caso Voriconazol (L): [^99mTc(CO)₃-L]⁺, se realiza tomando una alícuota de 250 L del precursor neutralizando al que se le adicionan 550 L de agua y 5 mg de Voriconazol (L) previamente disuelto en 200 L de EtOH. Se incuba en baño de agua a 70º durante 20 minutos. Se controla la pureza radioquímica por HPLC con el mismo sistema antes mencionado.

Estabilidad en el tiempo

Se controla la estabilidad del compuesto tricarbonilo-voriconazol a lo largo del tiempo a 1 y 3 horas post marcado, utilizando el mismo sistema de HPLC.

Estabilidad frente a Histidina o Cisteína

Se determina la estabilidad del compuesto tricarbonilo-voriconazol incubando el mismo conjuntamente con una solución acuosa de histidina (0,8 mg/mL) en baño de agua a 37ºC. El mismo proceso se realiza incubando con una solución de cisteína en idénticas condiciones a las antes mencionadas. Ambos procesos son controlados por HPLC.

Unión a proteínas plasmáticas

Se incuba por triplicado 25 µL del compuesto tricarbonilo-voriconazol con 475 µL de plasma humano en un baño de agua a 37ºC. Se controla la unión a proteínas plasmáticas a 30 y 60 min, tomando 50 µL de la mezcla y sembrando en una mini columna de gel filtración (Sephadex G50). Se centrifuga a 2000 rpm durante 2 min y se mide el número de cuentas obtenido en el eluído y el remanente en la columna.

Unión a levaduras.

Se preparan las soluciones descritas en la Tabla 1. Todas las soluciones y viales deben ser mantenidos en frío (baño de hielo).

Solución A	Buffer fosfato 14 mM pH 7,5
Suspensión B	Suspensión de C. Albicans de 12 x 108 ufc/mL
Solución C	Tween 80 al 0,01% en buffer A (v/v).
Solución D	Ácido acético al 0,1 % (v/v).
Solución E	Mezclar v/v solución C y D inmediatamente antes de su uso y almacenar a 4ºC.

Se trabaja con una suspensión de Cándida Albicans (susp. B) en solución A. A partir de ésta se preparan 7 diluciones al medio seriadas de B con solución salina NaCl 0,9% en tubos Eppendorf y un blanco solo con NaCl 0,9%. El volumen final en tubo es 0,4 mL.

A cada tubo se adicionan 0,8 mL de solución E, se incubi 15 min a 4ºC y se agrega a cada uno 0,1 mL de la molécula marcada diluida previamente a 1/10 en buffer A. Se incuba 1 h a 4ºC. Se mide la actividad total a toda la serie. Se centrifuga a 2500 rpm durante 5 minutos a 4ºC, se descarta el sobrenadante, luego se resuspende el pellet en 1 mL de solución E y se vuelve a centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se descarta cuidadosamente el sobrenadante cuidando de no remover el pellet y se mide la actividad final del pellet. Todo el procedimiento se realiza por duplicado.

Modelo animal

Se trabajó con Ratas Wistar hembras de 3 meses, peso 200 ± 20 g. Los modelos de inflamación e infección fueron previamente autorizados por la Comisión Honorara de Experimentación Animal (CHEA 07-05-10) y se detallan en la Tabla 2.

Luego 48 horas de desarrollo de la lesión se inyectó en vena de la cola 2,6 a 5,5 MBq (0,07-0,15mCi) de [99mTc (CO)3-Voriconazol] en los 4 grupos de animales (N=5) y se realizaron biodistribuciones a 1 y 4 horas post inyección a cada animal. Una vez transcurridos los tiempos de biodistribución, se procedió a la disección de los animales, midiendo la actividad presente en los órganos de interés así como también en la muestra de tejido muscular extraído de la pata sana y de la lesionada. También se realizaron imágenes por centellografía gamma de tres ejemplares de animales sanos, con inflamación y con infección.

Grupo (N=5)	Lesión en pata izquierda trasera	Modo de inducción	Tiempo de desarrollo de lesión
1	Inflamación estéril	100 µL de emulsión al 50% trementina/H20. Vía ip	48h
2	Infección C.Albicans	100 µL suspensión 108 cfu. Via ip	48 h
3	Infección A.Niger	100 µL suspensión 108 cfu. Via ip	72 h
4	Control (sanas)	100 µL NaCl 0,9% estéril. Via ip	48 h