Materiales y métodos

Marcación con ^99mTc

La marcación mediante la formación de complejos ^99mTc(III) “4+1” fue realizada en dos pasos utilizando ^99mTc-EDTA/Manitol como complejo precursor. Éste fue obtenido por agregado de ^99mTcO₄- (20 mCi) y SnCl₂ (6,0 mg en 50 µL de HCl concentrado y 6,0 mL de H2O) a una solución acuosa de EDTA (5,0 mg) y manitol (5,0 mg), ambos en 200 µL de H2O e incubando 10 min a temperatura ambiente. La pureza radioquímica (PR) fue controlada mediante cromatografía en papel Whatman nº1/acetona. La formación del complejo final ^99mTc(METNC)NS₃ se logra mezclando 200 µL del precursor con 100 µL de una solución de coligando 2,2’,2’’-nitrilotris etanotiol (NS₃) (0,6 mg en 200 µL de H₂O) y 1,0 mL de una solución de ligando METCN (0,2 mg en 2,0 mL de acetonitrilo) e incubando a 60 ºC durante 1 h. La (PR) fue determinada mediante HPLC de fase reversa acoplado a un detector gama NaI(Tl) utilizando una columna Waters C18 (Bondapack™ 125 Å, 10 µm, 3,9 x 300 mm), y un gradiente de fase móvil: (A) ácido tifluoroacético 0,1% en agua y (B) ácido trifluoroacético 0,1% en acetonitrilo a un flujo de 1,0 mL/min, el gradiente de solventes se muestra en la tabla 1.

Tiempo (min)	Ac. Trifluoroacético en CH3CN (%)
0-3	0
3-10	0-100
10-20	100

El complejo ^99mTc(I)–tricarbonílico “2+1” se preparó a partir del precursor fac[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺, obtenido a partir de borohidruro de sodio (7,0 mg), tartrato de sodio y potasio (20 mg) y carbonato de sodio (4,0 mg) bajo atmósfera de CO(g) con posterior agregado de ^99mTcO₄Na (20 mCi) e incubación a 65-70 ºC durante 30 min. Su PR fue controlada mediante HPLC de fase reversa con una columna Phenomenex C18-LUNA (5µm, 150x4,60mm), flujo 1,0 mL/min y como fase móvil metanol y una solución de H₃PO₄(aq) llevada a pH=2,5 con trietilamina. El gradiente de solventes utilizado se encuentra en la tabla 2.

Tiempo (min)	% solución H3PO4	% MeOH
0-3	100	0
3-6	100-75	0-25
6-9	75-66	25-34
9-20	66-0	34-100
20-27	0	100
27-30	0-100	100-0

Posteriormente se realizó una primer sustitución con el coligando 2,4-Pentanodiona (acetilacetona). Para ello se mezclan 250 µL de precursor previamente neutralizado con 100 µL de NaH₂PO₄ (390 mg/mL) y se agregan 300 µL de una solución acuosa 0,1M del coligando, incubando a 80 ºC durante 30 min. Su PR fue controlada en las mismas condiciones que el precursor correspondiente. El último paso consistió en mezclar 150 µL de este complejo intermediario y adicionar 3,0 mg del ligando METCN y calentar 30 min a 80 ºC. La PR del complejo final fue controlada con las condiciones anteriormente mencionadas.

Lipofilicidad y unión a proteínas plasmáticas

Para cada complejo obtenido por la lipofilicidad fue estudiada a pH 7,4 a través de la determinación del correspondiente coeficiente de repartición octanol/buffer. Para ello, fueron mezclados 2,0 mL de octanol en un tubo de centrífuga con 2,0 mL de buffer fosfato 0,1M, pH=7,4. Se agregaron posteriormente 100 µL del complejo a estudiar, agitándose mediante vórtex durante 2 min. La mezcla fue centrifugada por 5 min a una velocidad de 5000 rpm y, una vez separadas ambas fases, se midió la actividad en alícuotas de cada una de ellas en un contador de centelleo sólido de NaI(Tl) de 3”x 3”.

La unión a proteínas plasmáticas fue determinada por el método de exclusión molecular, luego de 60 min de incubación de 50 µL de cada complejo marcado con 950µL de plasma humano a 37ºC. Para ello, fueron sembradas muestras de plasma (50 µL) sobre columnas Microespin conteniendo Sepahdex® G-50. La elución se realizó centrifugando las columnas a 3300 rpm durante 2 min. La actividad retenida en la columna y la actividad eluída fueron medidas en un contador de centelleo sólido de NaI(Tl) de “3x 3”.

Estabilidad en el tiempo, en plasma humano y en L-cys

La estabilidad en el tiempo de los complejos de interés se analizó tomando muestras de cada uno de ellos y controlando su PR mediante HPLC de fase reversa acoplado a un detector gamma en las condiciones de solventes nombradas con anterioridad, a los 30 min y a 1, 2, 3 y 4 h post-marcado.

La estabilidad en plasma humano fue estudiada realizando la incubación a 37ºC de 100 µL del complejo de interés con 900 µL de plasma humano, retirando muestras a los 30 min, 1 y 2 h post-incubación. A cada muestra se le adicionan 100 µL de etanol absoluto a -15.0ºC y esta mezcla se mantuvo en frío durante 5 min. Una vez transcurrido el tiempo, se centrifugó a 15000 rpm durante 5 min a 0ºC. Finalmente se tomaron muestras del sobrenadante generado y se realizó el control de PR mediante HPLC de fase reversa acoplado a un detector gama en las condiciones de solventes adecuadas para cada marcado.

La estabilidad en L-cys se estudió mediante la incubación de 100 µL de cada complejo con 0,4 mg de L-cys a 37ºC. Se realizan tomas de la mezcla a los 30 min, 1 y 2 de incubación analizando su PR mediante HPLC de fase reversa acoplado a un detector gamma en las condiciones de solventes adecuadas para cada marcado.